博士研究生：胡贵鹏（2022年江苏省优秀博士学术学位论文）

导师：刘立明 教授

专业：发酵工程

论文题目：CO₂封存工程改造微生物生产L-苹果酸

摘要：大气CO₂浓度的不断升高是造成气候变化的重要原因，传统的物理化学CO₂封存技术存在运行成本高、产生有害物质等缺点。微生物CO₂固定为此提供了一条经济、环保的解决途径，且可以同时伴随高附加值化学品的生产，帮助缓解资源紧张。本论文以微生物封存CO₂生产L-苹果酸为研究模型，基于化学计量学和文献挖掘分别设计了自养协同CO₂固定途径、异养协同CO₂固定途径、新型光驱动CO₂固定系统以及新型光驱动CO₂减排系统。结合代谢工程与合成生物学技术手段，实现了上述理性设计的构建与优化，提高了细长聚球藻UTEX2973固定CO₂生产L-苹果酸的效率，增强了大肠杆菌MG1655的CO₂固定效率以及L-苹果酸的生产性能。主要结果如下：1.基于化学计量学发现蓝细菌固定CO₂生产L-苹果酸存在光暗反应能量不匹配的问题，并设计了基于能量平衡的协同CO₂固定途径；通过体外实验筛选出高效的协同CO₂固定途径酶,包括来源于产琥珀酸放线杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(As PCK)和L-苹果酸脱氢酶(As MDH)；将As PCK和As MDH引入细长聚球藻UTEX2973，实现了协同CO₂固定途径的构建，使得工程菌株SH006的CO₂固定效率提高73%，同时L-苹果酸产量从低于检测限提升至200μM；进一步优化协同CO₂固定关键酶的表达比例并敲除L-苹果酸代谢去路，工程菌株SH108的L-苹果酸产量提升至480μM；最后,在发酵优化条件下，菌株SH108的L-苹果酸产量可以达到950μM(0.13 g/L)；2.基于化学计量学设计了用于大肠杆菌生产L-苹果酸的协同CO₂固定途径,途径主要由ATP依赖型的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Ru Bis CO)支路和ATP再生型的PCK还原支路构成。以大肠杆菌MG1655为宿主，引入来源于Synechocystis sp.PCC6803的5-磷酸核酮糖激酶、Ru Bis CO和碳酸酐酶(CA)，成功构建了Ru Bis CO支路；在此基础上，阻断L-苹果酸降解和碳流竞争途径并引入As PCK和As MDH，实现了协同CO₂固定途径的重构，使得工程大肠杆菌GH089的CO₂固定效率提高了49倍，L-苹果酸产量从7.9 m M增加到106 m M；进一步对协同CO₂固定途径关键酶Ru Bis CO和CA进行表达比例优化,最优工程菌株GH389的CO₂固定效率由36.5 mg/g DCW提升至49mg/g DCW；利用3.6-L生物反应器对菌株GH389进行发酵，最终的L-苹果酸产量达到387 Mm(51.8 g/L)；3.基于文献挖掘和热力学分析设计了一条由甲酸脱氢酶、甲酰基四氢叶酸环水解酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、甲醛裂合酶(FLS)和二羟基丙酮激酶组成的新型CO₂固定途径，命名为HWLS。利用无细胞体系验证了HWLS途径的可行性，并诊断出FLS催化的反应为限速步骤；针对该限速酶，发展了新型高通量筛选方法，并基于该方法成功获得了酶活提高的突变体FLS*,使得HWLS途径效率提高1.3倍；将优化后的HWLS途径引入一株积累L-苹果酸的大肠杆菌FH0210，并与自组装Cd S纳米捕光系统进行整合,所构建的工程菌株LF-2在蓝光、厌氧条件下将L-苹果酸得率从1.26 mol/mol提高至1.64 mol/mol；进一步优化发酵条件后，菌株LF-2在厌氧转化阶段获得了1.85 mol/mol的L-苹果酸得率；4.基于计算机模拟流量平衡分析，大肠杆菌在好氧条件下生长时约有34%的碳以CO₂的形式丢失。针对主要的CO₂释放源—TCA循环，设计了基于蓝细菌转录因子Ndh R的动态调控开关，以及基于海洋浮游生物视紫红质蛋白的光驱动ATP再生系统。克隆来源于Synechocystis sp PCC 6803的转录调控单元P_N和Ndh R并进行理性改造,成功构建了可以响应大肠杆菌胞内α-酮戊二酸的分子开关P_N2-Ndh R；利用开关P_N2-Ndh R调控TCA循环起始基因glt A，实现了TCA循环的动态下调以及细胞整体CO₂释放水平的降低；进一步构建基于视紫红质蛋白的ATP再生系统，完成了光驱动CO₂减排系统的构建，提高了工程大肠杆菌在好氧生长阶段的碳利用率。将好氧CO₂减排系统与第四章中的厌氧CO₂固定系统进行两阶段发酵整合后，工程菌株LFM-2在整个发酵阶段的L-苹果酸得率达到1.48 mol/mol，超过约束模型下计算得到的理论得率。

关键词：CO₂固定；CO₂减排；碳流调控；L-苹果酸

博士研究生：郭亮（2022年江苏省优秀硕士学术学位论文）

导师：刘立明 教授

专业：发酵工程

论文题目：时空代谢调控大肠杆菌生产精细化学品

摘要：大肠杆菌细胞工厂利用可再生资源为原料，生产多种工业化学品。大肠杆菌细胞工厂的生产性能会显著影响了工业化学品生产的经济适用性。因此，如何进一步提高大肠杆菌细胞工厂的生产性能是目前工业生物技术面临的主要挑战。为了应对这个挑战，本论文以大肠杆菌为研究模型，拟从大肠杆菌的生理状态和生理结构为出发点，发展了周质空间工程、动态调控细胞生长和细胞寿命等策略。通过减弱目标化学品合成路径与内源代谢路径交互作用、平衡细胞生长与产物合成与延缓大肠杆菌细胞的衰老与凋亡，提高了大肠杆菌细胞工厂的生产性能。主要研究结果如下：1.基于周质空间工程重构苹果酸合成路径：以E.coli ATCC8739为出发菌株，借助多基因组合敲除策略，构建了苹果酸前体磷酸烯醇式丙酮酸库;通过构建位于胞质的TCA还原途径，将代谢流从磷酸烯醇式丙酮酸引向苹果酸，获得了合成苹果酸的底盘微生物；并利用Pel B信号肽，在周质空间中重构了TCA还原途径，使苹果酸产量增加到18.8 mmol/L；基于双代谢工程策略,平衡细胞质和周质空间中代谢流分布提高了苹果酸产量。最终，采用分批补料发酵,使苹果酸产量达到193 mmol/L。2.动态调控策略平衡细胞生长与丁酸合成：基于文献挖掘，设计了丁酸代谢合成路径，构建了合成丁酸的底盘微生物，并通过强化乙酰辅酶A供应，使丁酸产量增加到5.6g/L；基于位点特异性DNA重组酶Bxb1，构建了Turn-on,Turn-off和RBI(recombinasebased inverter)三种动态调控开关；利用Turn-on调控丁酸合成途径使丁酸产量增加到6.6 g/L，利用Turn-off调节细胞生长使丁酸产量增加到10 g/L；通过RBI实现了动态双调控策略，平衡了细胞生长与丁酸合成，使丁酸产量进一步增加到34 g/L，其生产强度为0.405 g/L/h。3.调控时序寿命改善丁酸生产：利用基因工程手段获得控制大肠杆菌细胞时序寿命的关键靶点ubi G、rss B和rpo S；将ubi G、rss B和rpo S引入到丁酸生产菌株，构建了工程菌BUT-5，使丁酸产量增加40%，达到10.5 g/L；通过组合蛋白降解决定子和具有正交性的位点特异性DNA重组酶，建立了具有双输入与四输出功能的逻辑门状态机器；将丁酸生产菌株的细胞命运分为四种，并分别与逻辑门状态机器的四个输出信号相连，获得工程菌BUT-6,使丁酸的产量达到29.8 g/L，其生产强度为0.414 g/L/h。4.调控复制寿命提高聚(乳酸-co-3-羟基丁酸)积累：基于遗传表型分析获得控制大肠杆菌复制寿命的关键靶点csr A；将csr A引入到聚(乳酸-co-3-羟基丁酸)生产菌株，获得工程菌PLH-3，使聚(乳酸-co-3-羟基丁酸)的含量增加33.3%；基于位点特异性DNA重组酶和重组酶定位识别因子，构建了双向逻辑门状态机器；将聚(乳酸-co-3-羟基丁酸)生产菌株的细胞命运分为两种，分别与逻辑门状态机器的两个输出信号相连接，获得工程菌PLH-4，实现了聚(乳酸-co-3-羟基丁酸)在大肠杆菌中的不对称分布。5.调控细胞凋亡改善赖氨酸生产：研究了高浓度赖氨酸对大肠杆菌细胞生长的影响，发现高浓度赖氨酸通过增加胞内活性氧的积累，加速了大肠杆菌细胞的凋亡和死亡；利用遗传表型分析,获得延缓大肠杆菌细胞凋亡和死亡的关键靶点hns和arc A，有效改善了赖氨酸的生产；根据大肠杆菌全基因编码序列第二位密码子的分布，提出并验证了调控基因表达的第二位密码子工程策略；利用第二位密码子工程精细化调控了大肠杆菌细胞凋亡，增加了赖氨酸产量。最终，在7.5 L发酵罐中使赖氨酸产量提高到198.3 g/L。

关键词：大肠杆菌；生理状态；细胞寿命；重组酶

硕士研究生：王镓萍（2022年江苏省优秀硕士学术学位论文）

导师：刘立明 教授

专业：微生物学

论文题目：多酶级联转化L-赖氨酸高效生产戊二酸

摘要：戊二酸是一种重要的五碳化合物，被广泛应用于塑料化工、医药和农业等领域。与传统的化学合成法相比，以5-氨基戊酸为底物的酶转化法是目前备受关注的戊二酸生物合成法之一。但是其底物价格昂贵，且产量、产率和生产强度并未达到大规模工业化生产的要求。本研究开发了以廉价易得的L-赖氨酸为起始底物，通过多酶级联转化生产戊二酸，并结合RBS调控、蛋白质工程以及转运工程等策略，显著提高了转化L-赖氨酸生产戊二酸的催化效率。主要研究结果如下：(1)戊二酸合成级联路径的设计与构建：首先，以比酶活和初始反应速率为筛选指标，确定Escherichia coli来源的赖氨酸脱羧酶(Ec CA)、Klebsiella pneumoni来源的丁二胺转氨酶(Kpc PA)和γ-氨基丁醛脱氢酶(Kpc PD)以及Pseudomonas fluorescens来源的4-氨基丁酸转氨酶(Pfe GT)和琥珀酸半醛脱氢酶(Pfe GD)作为级联反应的最佳路径酶。其次，通过体外重构戊二酸合成级联反应，质谱分析确定了戊二酸的生成,进而验证了上述五酶级联路径合成戊二酸的可行性。(2)戊二酸上游合成路径的重构与优化：首先，通过研究单个路径酶浓度对上游合成路径初始反应速率的影响，确定Kpc PA是限速酶。基于此，采用正交优化实验，确定上游合成路径中的3个酶存在协同作用，且当Ec CA:Kpc PA:Kpc PD=4:8:7时，初始反应速率达到最高为179μM NADH·min^-1，与优化前(25μM NADH·min^-1)相比，提高了7.2倍。其次，借助RBS调控策略优化路径酶Ec CA、Kpc PA和Kpc PD的表达水平，使得重组菌株AVA-02的5-氨基戊酸产量达到21.6 g·L^-1，出发菌株AVA-01(11.7 g·L^-1)相比，提高了84.6%。第三，结合体积扫描和疏水性扫描等蛋白质工程改造策略，筛选出可能有利于提高Kpc PA对底物戊二胺催化活性的12个潜在突变位点，并成功筛选获得E120G和T332A两个有益突变位点，最终双突变体Kpc PA^E120G/T332A的比酶活提高到75.87±1.51U·mg^-1，是野生型Kpc PA的4.77倍。将菌株AVA-02中的Kpc PA替换成Kpc PA^E120G/T332A，使得重组菌株AVA-03的5-氨基戊酸产量达到29.5 g·L^-1,与重组菌株AVA-02相比，提高了36.6%。(3)戊二酸下游合成路径的重构与优化：首先，通过研究单个路径酶浓度对下游合成路径初始反应速率的影响，确定Pfe GT和Pfe GD酶活性对戊二酸的生产无显著影响。此外，下游合成路径的整体初始反应速率(282μM NADH·min^-1)远高于上游合成路径(25μM NADH·min^-1)，证实了下游合成路径中不存在限速酶。其次，通过对下游合成路径的底物利用能力进行评估，确定5-氨基戊酸从胞外到胞内的转运是影响其利用能力的关键。通过过表达4-氨基丁酸转运蛋白(Gab P)，使得重组菌株Glu-02的5-氨基戊酸转运效率得到有效提高，5-氨基戊酸积累量由8.9 g·L^-1降低至1.2 g·L^-1，而戊二酸产量由32.5g·L^-1提高至41.2 g·L^-1，与重组菌株Glu-01相比，提高了26.8%。(4)戊二酸合成级联路径的组装与应用：首先，在E.coli F0723中组装最优的戊二酸上游合成路径与下游合成路径，获得重组菌株Glu-03。其次，通过摇瓶水平的发酵条件优化,确定菌株Glu-03的最佳产酶条件为:细胞生长至OD₆₀₀为0.8时加入0.4 m M IPTG，25℃诱导表达14 h；最佳全细胞转化条件为：温度30^oC、p H 8.5、0.6 m M NAD⁺、50 m Mα-KG、1.0 g·L^-1曲拉通(X-100)和30 g·L^-1湿菌体。最后，将最佳转化体系进一步放大到5-L发酵罐，经42 h转化，戊二酸产量达到77.6 g·L^-1，转化率、产率和生产强度分别为85.9%、0.78 g·g^-1 L-赖氨酸和1.85 g·L^-1·h^-1。

关键词：戊二酸；L-赖氨酸；RBS调控；蛋白质工程；多酶级联

硕士研究生：李洋（2022年江苏省优秀硕士学术学位论文）

导师：陈修来 教授

专业：发酵工程

论文题目：代谢工程改造大肠杆菌生产己二酸

摘要：己二酸，作为生产尼龙、化工纤维和工程塑料等聚合物的单体，在食品、医药、塑料和化工行业具有广泛的应用。目前，己二酸的生物合成主要依赖于可食用原料，然而碳原子损失较多，造成己二酸的产率较低。脂肪酸，作为自然界中一种丰富的原料，具有高效生产高价值化学品的潜力：一方面，脂肪酸的使用能避免与可食用粮食作物的竞争，降低了生产成本；另一方面，经脂肪酸分解代谢可以实现100%的碳原子回收率，理论上具有更高的产品产率。本论文通过组合β-氧化路径和ω-氧化路径，人工设计了一条利用脂肪酸生产己二酸的合成路径。随后，采用多种代谢工程改造策略，优化己二酸合成路径，不仅提高了细胞对脂肪酸的利用能力，而且增强了棕榈酸到己二酸的转化效率。主要研究结果如下：1.构建和强化内源β-氧化路径。首先，由于野生型大肠杆菌(Escherichia coli)不能有效利用棕榈酸合成正己酸，通过过量表达fad L、fad D、fad E、fad B、fad A、ydi I基因，强化内源β-氧化路径，使得重组菌株E.coli AA0108能够合成0.67 g·L^-1正己酸。其次，通过分析辅因子FAD浓度对正己酸合成的影响，表明胞内辅因子FAD的不足是限制正己酸合成的关键因素之一。最后，通过过量表达博伊丁氏假丝酵母(Candida boidinill)的甲酸脱氢酶(fdh)和E.coli的NADH氧化酶(nox)，构建了辅因子再生系统。最终，重组菌株E.coli AA0109合成0.77 g·L^-1正己酸，与菌株E.coli AA0108相比提高了14.93%。2.重构和优化外源ω-氧化路径。首先，经全细胞转化表明，野生型E.coli不能氧化正己酸合成己二酸，需要通过代谢工程策略构建ω-氧化路径。其次，通过数据库和文献挖掘异源构建了ω-氧化路径，包括恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的烷烃羟基化系统(Alk BGT)和不动杆菌属(Acinetobactor sp.)的6-羟基己酸脱氢酶(Chn D)和醛脱氢酶(Chn E)，使得重组菌株E.coli AA0201能够合成0.61 g·L^-1己二酸。接下来，以绿色荧光蛋白为报告基因，筛选获得分别为高、中和低强度的RBS30、RBS34和RBS32。最后，利用筛选的RBS模块化工程优化ω-氧化路径，通过调节羟化模块(alk B、alk G和alk T基因)和氧化模块(chn D和chn E基因)的表达水平，平衡异源基因的表达和降低副产物的形成。经全细胞转化验证，上调羟化模块和下调氧化模块均能有效提高己二酸的产量。其中，下调氧化模块(菌株E.coli AA0204)使己二酸产量提高至0.76 g·L^-1，与菌株E.coli AA0201相比提高了24.59%。3.组装和测试己二酸合成路径。首先，通过组装最适的β-氧化路径和ω-氧化路径，实现了棕榈酸到己二酸的直接转化。经全细胞转化测试，重组菌株E.coli AA0301能够利用棕榈酸合成57.00 mg·L^-1己二酸。其次，通过优化棕榈酸的流加方式，表明补料-分批发酵可以提高己二酸产量至0.35 g·L^-1，与分批发酵相比提高了3.18倍。再次，采用多种代谢改造策略,增强了细胞对脂肪酸的利用能力。一方面，敲除脂肪酸代谢调控蛋白(fad R基因)，缩短了菌株E.coli AA0304生长的延迟期；另一方面，优化脂肪酸转运蛋白(fad L基因)的表达水平，改善了脂肪酸从胞外进入胞内的速率。经摇瓶发酵，重组菌株E.coli AA0306能够产生0.52 g·L^-1己二酸，同时细胞的生长速率提高了32.00%。接下来，通过改变脂肪酸和葡萄糖的流加方式，增强了己二酸的合成效率。通过采用分批补加棕榈酸和控制低浓度葡萄糖的策略，可以使己二酸的积累量达1.62 g·L^-1。最后，在5 L发酵罐中，最优菌株E.coli AA0306经过96 h的发酵，己二酸产量和产率分别为4.66 g·L^-1和0.23 g·g^-1。

关键词：代谢工程；氧化路径；大肠杆菌；棕榈酸；己二酸