优秀学位论文

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1)硕士研究生: 程 功(2017年江苏省优秀硕士学位论文)

导师: 张伟国 教授

专业: 生物工程

论文题目:L-精氨酸高产菌的选育及其发酵条件的研究

摘要:L-精氨酸(L-arginine, Arg)是半必需的碱性氨基酸,因其具有特殊的生理功能,而被广泛应

用于饲料、医药、食品以及化妆品等行业。随着我国对L-精氨酸的需求量迅速增长,目前国内生产能力已

不能满足市场的需求。且国内精制L-精氨酸主要依赖于进口。因此,为打破国外L-精氨酸生产垄断地位,

选育出具有自主知识产权的L-精氨酸生产菌株具有重要意义。本文以传统诱变方法赋予出发菌株特定的抗

性标记来提高L-精氨酸产量,随后初步分析该突变株中L-精氨酸产量提高的原因,优化发酵培养基及发酵

条件,拓展菌株底物利用以及在分批过程中优化溶氧及补糖。主要研究结果如下:

1.以Corynebacterium glutamicum GUI096为出发菌株,经常压室温等离子体生物诱变系统逐级诱变

处理,赋予出发菌株新的遗传标记L-高精氨酸抗性(L-HAr)和8-氮鸟嘌呤抗性(8-AGr),筛选出一株

L-精氨酸产量较高的突变株C. glutamicumARG 3-16,该突变株对L-HA和8-AG的耐受浓度分别达到15

g·L-1和0.7 g·L-1,L-精氨酸产量达到35.95±0.74 g·L-1,比出发菌株提高了49.79%。

2.对突变株C. glutamicum ARG 3-16的基因核苷酸序列分析,实验发现关键酶基因argB(编码N2-乙

酰谷氨酸激酶)、argJ基因(编码鸟氨酸乙酰转移酶)以及阻遏蛋白基因argR发生了不同程度的突变,它

们编码的酶氨基酸序列也发生了相应的改变,特别是argR基因的突变导致编码阻遏蛋白翻译提前终止,从

而解除了反馈阻遏作用。N2-乙酰谷氨酸激酶对外源L-精氨酸耐受性实验发现突变株中N2-乙酰谷氨酸激

酶对外源L-精氨酸耐受性增强,从而表明L-精氨酸对N2-乙酰谷氨酸激酶的反馈抑制作用得到弱化。

3.在单因子实验的基础上,应用Plackett-Burman设计从7个因素中筛选出对L-精氨酸合成具有显著效

应的(NH4)2SO4、葡萄糖和尿素3个因素。通过Box-Behnkne实验分析了发酵生产L-精氨酸的最优摇瓶发

酵培养基(g·L-1):葡萄糖155,(NH4)2SO4 58.95,玉米浆20,尿素2.2,KH2PO4 0.75,MgSO4·

7H2O 0.5,生物素8.0×10-5。并通过单因素实验优化了L-精氨酸发酵条件如下:初始pH 7.0,发酵温度

30°C,碳酸钙40 g·L-1,装液量30 mL,接种量10%,种龄16 h,最终产酸达到41.38±0.85 g·L-1,

比优化前提高了15.10%。

4.甜菜糖蜜是蔗糖工业的副产物,含有丰富的营养物质。本实验将甜菜糖蜜与葡萄糖进行协同发酵生

L-精氨酸,实验发现当混合发酵甜菜糖蜜的质量比为15%时L-精氨酸产量最高,达到42.88±0.63 g·

L-1。研究发现甜菜碱是甜菜糖蜜中影响L-精氨酸产量的最主要的因素,当甜菜碱1 g·L-1时L-精氨酸产

量达到最高(即44.27±0.87 g·L-1),比添加前提高了6.98%。其原因可能是甜菜碱可以直接进入胞内

保护胞内酶的活性,提高菌株渗透压耐受性来促进细胞的生长。

5.在7 L发酵罐中对L-精氨酸发酵过程中的溶氧和补糖进行了控制优化。研究发现在L-精氨酸发酵过程

的不同发酵阶段以不同供氧方式来控制发酵培养基中的溶氧浓度,从而可以促进L-精氨酸的积累。分阶段

溶氧控制下L-精氨酸产量达到53.21±0.94g·L-1,比优化前提高了9.69%。另外通过分阶段流加葡萄糖

来控制发酵培养基中葡萄糖浓度在10-30 g·L-1范围内,以降低渗透压对菌体生长和L-精氨酸合成的影

响,最终L-精氨酸产量达到58.34±1.25 g·L-1。

关键词:L-精氨酸;谷氨酸棒状杆菌;选育;常压室温等离子体;优化


2)硕士研究生: 樊祥臣(2017年江苏省优秀硕士学术学位论文)

导师: 刘立明 教授

专业: 发酵工程

论文题目:L-谷氨酸酶法生产α-酮戊二酸的条件优化

摘要:α-酮戊二酸(alpha-ketoglutaric acid, α-KG)作为一种重要的有机酸,被广泛应用于医药、食品

和精细化工等领域,目前酶法催化L-谷氨酸生产α-KG的研究已取得一定进展。本研究室前期构建了一条

利用重组L-谷氨酸氧化酶(L-glutamate oxidase, LGOX)催化L-谷氨酸生产α-KG的新途径。但仍存在

LGOX产酶效率低,不能满足工业化生产和市场需求,催化过程中需要添加过氧化氢酶消除副产物H2O2的

抑制作用,增加了生产成本等缺点。为有效解决这些问题,本文从高密度发酵技术和构建高效双酶共表达

菌株两个方面开展研究,为LGOX酶法生产α-KG的工业化生产开辟前景。主要的研究结果如下:

1.通过提高细胞密度和LGOX酶活的策略提高LGOX产量。以工程菌株FMME089为出发菌株,采用廉

价、无毒的乳糖代替IPTG作为诱导剂,LGOX酶活由3.12 U·mL-1提高到4.73 U·mL-1;在对DO-

stat和指数补料分析基础上,提出了指数补料与DO-stat相结合的两阶段补料策略,将细胞浓度由2.49 g·

L-1提高到41.6 g·L-1,LGOX酶活为59U·mL-1。通过优化指数补料速率μset和诱导条件,细胞浓度达

48.4 g·L-1,LGOX酶活提高到156.1 U·mL-1,分别是摇瓶发酵的19.4倍和50倍。

2.高密度细胞直接应用于全细胞转化L-谷氨酸生产α-KG,在110 g·L-1底物水平下,单位体积发酵液

所得菌体转化获得α-KG的量是较摇瓶菌体的48倍。进一步提高底物浓度,通过优化反应体系,反应24 h

132 g·L-1底物条件下α-KG产量达到127.2 g·L-1,转化率为97.0 %,产量提高了23.3%。

3.通过对LGOX和KatG过氧化氢酶-过氧化物酶基因)酶学性质的研究,评估其催化水平;随后在转录水

平构建LGOX和KatG共表达菌株,发现单启动子双酶串联表达菌株F008更有利于α-KG的生产;随后,对单

启动子双酶串联表达菌株中KatG基因前的SD序列与ATG之间的间隔进行优化,分别间隔3 bp, 6 bp, 9 bp和

12 bp获得菌株FXC003~FXC006,分析产酶效果和转化效果发现FXC005的效果最优,LGOX和KatG酶活分

别为2.86 U·mL-1和935.8 U·mL-1,转化24 h α-KG产量提高到86.7 g·L-1,转化率79.6%,仍没有

达到完全替代过氧化氢酶的目的;因此,通过计算预测合适翻译起始速率(TIF)的RBS序列以提高KatG有效

表达量,得到一株高效生产LGOX和KatG的共表达菌株F006。F006在TB培养基中,OD600=0.6时0.4

mmol·L-1 IPTG诱导5 h,LGOX和KatG酶活分别为2.09 U·mL-1和1185.3 U·mL-1,此时全细胞催化

110 g·L-1 L-谷氨酸24 h,α-KG产量达到103.1 g·L-1,转化率为94.6%,很好的解决了需要添加外源

过氧化氢酶的问题。

关键词:L-谷氨酸氧化酶;高密度发酵;双酶反应体系;共表达菌株;全细胞转化。