（1）

硕士研究生：刘贝贝

导 师：聂 尧

专 业：发酵工程

论 文 题 目：半理性设计醇脱氢酶 TbSADH 合成重要医药中间体(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇

论 文 摘 要：

(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇是抗组胺类药物卡比沙明和苯磺酸贝他斯汀等合成中的 重要手性砌块。但目前主要是化学法合成，污染大且劳动保护要求高。虽然有生物法在 研究，但其催化效率和立体选择性远远达不到药物合成的要求。因此，本研究采用半理 性设计方法对来自高温厌氧杆菌（Thermoanaerobacter brockii）的醇脱氢酶（TbSADH） 进行定向进化改造。基于其晶体结构，通过分子动力学模拟对 TbSADH 催化口袋内氨 基酸残基进行分析，寻找影响口袋柔性的关键残基并进行改造，使其能够不对称还原高 效合成高 ee 值的手性醇产物。同时解析催化口袋重塑与催化效率及立体选择性的关联， 为同类型催化反应和酶分子改造研究提供理论和实践经验。具体内容包括：

（1）基于TbSADH晶体结构（PDB：1YKF），分别在30°C和60°C对野生型TbSADH 催化口袋内的氨基酸残基进行 100 ns 的分子动力学模拟，模拟结果中均方根涨落（Root mean square fluctuations, RMSF）值的波动情况可以反映氨基酸残基的柔性大小。结果发 现口袋内 A85、I86、L294 及 C295 位点相对于其它位点更为刚性，说明这些位点可能 是酶结合底物过程中产生阻碍的关键位点。因此对这四个位点进行计算机虚拟突变，A85 突变成甘氨酸，I86、L294 及 C295 位点则突变成丙氨酸。分子动力学模拟结果中 A85 及 I86 位点突变后会引起 RMSF 值明显波动，而其它位点却不明显，表明 A85、I86 是 影响构象动力学的关键位点。

（2）基于结构及分子动力学模拟分析，首先对 A85 及 I86 位点进行单位点饱和突 变，结果得到了一系列酶活较低的单突变体。为了优化立体选择性和酶活，再次针对 A85 及 I86 位点利用组合活性中心饱和突变策略（Combinatorial active-site saturation test， CAST）构建精准突变库，由于底物(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮空间位阻较大，因此通过简并 密码子设计将这两个位点组合突变为空间位阻较小的氨基酸残基（A、S、T、L、I、V、 G、C），最终筛选得到一系列酶活提高的突变体。其中最优突变体 T15（A85G/I86L） 催化底物生成(S)-醇产物具有 99% e.e.光学纯度和 98%的转化率。以纯化的突变体酶作 为催化剂考察不对称催化性能，进行动力学参数、热稳定性、酶促不对称反应及底物特 异性研究。研究结果表明，最优突变体 T15 具有优秀的催化潜力， kcat/Km 为 703.52 s -1 ×mM-1 ；底物浓度为 100 mmol×L -1 时，100 mL 体系中 4 h 就可达到完全转化，光学纯 度 99% e.e.，分离得率为 94%。热稳定性好且在底物谱测试中，对大多数酮底物也具有 很好的酶活力。通过 T15 与野生型的分子动力学分析，发现突变后催化口袋的体积由原 来的 141±33Å3 增加到 213±41Å3，证明突变体口袋的柔性得到增强。

（3）为了探究其它位点对活性及立体选择性的影响，首先以(S)-专一型突变体 T13 （A85G/I86A）为模板引入口袋内的 Q101、W110、L294 及 C295 位点，鉴于底物空间 位阻较大因此将这些位点均突变为位阻较小的丙氨酸（A）及丝氨酸（S）。通过活力测定得到的最优突变体 T33（Q101A/A85G/I86A），催化底物(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)- 醇产物具有 99% e.e.光学纯度和 98%的转化率。对优势突变体进行 TTN 及底物特异性研 究，结果表明突变体 T33 同样具有优异的催化潜力，TTN 达到 6555，同时对大多数底 物具有较好的催化活性。另外，以(R)-专一型突变体 I86P 作为模板引入 S39、Q101、 W110、L294 及 C295 位点进行饱和突变，所得最优(R)-专一型突变体转化率为 56%，光 学纯度 78% e.e.；(S)-专一型转化率为 71% ，光学纯度 70% e.e.。

关键词：

生物催化；半理性设计；醇脱氢酶；(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇

（2）

硕士研究生：杨 柳

导 师：田亚平

专 业：生物化学与分子生物学

论 文 题 目：球毛壳（Chaetomium globosum）产 α-葡聚糖苷酶的诱变，优化及酶学特性

论 文 摘 要：α-葡聚糖苷酶，也称为右旋糖酐酶（E.C. 3.2.1.11），是一种能特异性水解 α-葡聚糖 （右旋糖酐）分子中的 α-1,6 糖苷键生成一些低聚线性寡糖的水解酶。该酶主要应用于 甘蔗制糖、药用葡聚糖的制备及龋齿防治方面，在化工，医药检测等方面也有较大的应用价值。

本论文通过比对菌株在蓝色葡聚糖筛选平板上产生的透明圈大小，成功从土样中分 离出一株新型 α-葡聚糖苷酶生产菌株，观察菌体形态并分析基因序列后，确定为球毛壳 （Chaetomium globosum），并保存在中国微生物菌种保藏中心（CGMCCC No.15867）。

用常压室温等离子体（ARTP）和甲基磺酸乙酯（EMS）结合的方法对球毛壳产 α[1]葡聚糖苷酶进行诱变。确定ARTP诱变的最佳条件为10 L·min-1的氦气距离载片2 mm 处 照射 120 s；EMS 诱变的最佳条件为 0.5 M 的 EMS 终浓度处理 4 h。两种方法连用后筛 选得到一株 α-葡聚糖苷酶阳性突变株，酶活为 49.53 U·mL -1，与原始菌株所产酶酶活 38.01 U·mL -1 相比提高 30.31%。诱变菌株传代数次稳定性皆良好。

优化确定产酶发酵培养基为：20 g·L-1 葡聚糖 T20，10 g·L-1 酵母提取物，2.0 g·L-1 K2HPO4 和 0.5 g·L-1 MgSO4，在此条件下发酵 8 d，α-葡聚糖苷酶的酶活达到 427.91 U·mL -1。优化摇瓶发酵条件为：初始 pH7.0、装液量 70 mL、200 r·min-1、28℃、接种量 6%，在此条件下发酵 8 d，α-葡聚糖苷酶的酶活达到 824.73 U·mL-1，是优化前酶活（49.53 U·mL -1）的 16.65 倍。

球毛壳 α-葡聚糖苷酶经硫酸铵盐析、透析、Sephadex G75 层析纯化后达到电泳纯， 比酶活为 8350.8 U·mg-1，纯化倍数为 11.81，回收率为 18.8%。对比诱变前后电泳纯的 α[1]葡聚糖苷酶性质发现，诱变前后的 α-葡聚糖苷酶最适 pH 和温度相同，均为 5.5 和 60℃， pH 在 4.5~7.0 和温度 20~50℃条件下的稳定性皆良好，诱变后的酶在 20~70℃的耐热性 高于诱变前。同源建模和分子对接技术发现诱变前后酶的催化中心都为 Asp 408、Asp 409 和 Asp 431，但诱变后酶的 578 位氨基酸由组氨酸变为亮氨酸，此差异可能使酶的 二级结构有微小变化而对性质有一定影响。

球毛壳α-葡聚糖苷酶是一种内切型葡聚糖苷酶，降解高分子量葡聚糖为各种分子量 的低聚糖且对高分子量葡聚糖的催化效率更高。终浓度为 2 U·mL-1 的酶催化浓度为 3% 的葡聚糖 T2000 反应 15 min，将其分子量从 2000 kDa 降解到 41 kDa。终浓度为 1 U·mL-1 的酶催化不同浓度的葡聚糖 T2000，当浓度为 3%时催化效率最高，分子量从 2000 kDa 降到 60.2 kDa。

球毛壳 α-葡聚糖苷酶可明显抑制变异链球菌的生长，进而抑制变异链球菌合成葡聚 糖生物膜，随着 α-葡聚糖苷酶浓度的增加，变异链球菌的生长速率降低，葡聚糖生物膜 的合成受到抑制，当酶浓度为 50 U·mL-1 时，抑制率为 71.58%，清除率达到 49.07%。 此酶在防治和清除牙菌斑方面有很大应用潜力。

关键词：

α-葡聚糖苷酶；ARTP-EMS 诱变；发酵优化；酶学特性

（3）

博士研究生：周婕妤

导 师：倪 晔

专 业：发酵工程

论 文 题 目：双芳基醇脱氢酶立体选择性的改造及机制研究

论 文 摘 要：

光学纯的双芳基醇是一类重要的手性砌块化合物，可广泛地用于药物、农业化学品 和天然产物的合成。光学纯(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)甲醇[(S)-CPMA)]是合成抗组胺贝 托司汀类药物的重要手性中间体，可通过不对称还原其前体(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)甲酮 （CPMK）而获得。由于底物酮的双芳基结构具有极大的空间位阻，只有少量醇脱氢酶 被报道具有不对称催化还原双芳基酮的活力，因此它们通常被称为“难还原”的酮类。在 前期工作中，本课题组采用基因挖掘的方法获得了来源于 Kluyveromyces polyspora 的 NADPH 依赖型短链醇脱氢酶 KpADH，该酶催化还原 CPMK 时表现出较高的底物转化 率和中等的立体选择性（82% ee, R）。本研究以 KpADH 为研究对象，对其进行蛋白质 工程改造以获得高立体选择性的生物催化剂，并对该醇脱氢酶的立体选择性催化机制及 酶法连续制备(S)-CPMA 进行了研究。主要结论如下：

（1） 根据 2,4-二硝基苯肼（DNPH）与羰基化合物的颜色反应特性，建立了醇脱 氢酶催化还原活力的高通量筛选方法。该方法具有成本低廉、灵敏度高、背景干扰小等 优点，可用于以芳香酮、双芳香酮、脂肪酮、二酮为底物的羰基还原酶催化活力的高通 量筛选。当以 CPMK 为底物时，其与 DNPH 反应生成产物在波长 500 nm 处具有特征吸 收峰，计算摩尔消光系数为 13750·L·mol-1 ·cm-1 。该 DNPH 检测法可适用于全细胞反应 体系及羰基还原酶底物特异性的表征。将该方法用于 KpADH 随机突变库的高通量筛选， 获得了三个催化活力提高的突变体 M131F，S196Y 和 S237A，它们的催化活力分别为 野生型 KpADH 的 1.5, 1.3 和 1.8 倍。此外，手性 HPLC 色谱检测结果显示突变体 S196Y 还原产物(R)-CPMA 的 ee 值下降至 74.7%，突变体 S237A 催化还原合成(R)-CPMA 的 ee 值提高至 96.1%，显示出 KpADH 立体选择性改造的潜力。

（2） 以来源于 Saccharomyces cerevisiae 的 NADPH 依赖型甲基乙二醛还原酶 GRE2 为模板构建 KpADH 的同源模型，确定其催化三联体为 Ser126-Tyr164-Lys168；之 后将其与底物 CPMK 分子进行半柔性对接，获得了 KpADH 底物结合口袋上 16 个氨基 酸位点。选择天冬氨酸 Asn 和 Val 分别作为“极性筛子”和“非极性筛子”，对 16 个残基 位点进行扫描，得到 6 个与 KpADH 立体选择性相关的突变位点 Q136，F161，S196， E214，T215 和 S237。之后基于这些位点饱和突变库的筛选结果采取“逐步优化组合策略” 构建突变文库，筛选获得了立体选择性提高的突变体 Mu-R2（99.2% ee，R）和立体选 择性翻转的突变体 Mu-S5（97.8% ee，S）。

（3） 为了研究双芳基醇脱氢酶催化立体选择性识别机制，对 WT KpADH 及其突 变体 Mu-R2 及 Mu-S5 进行蛋白质结晶，获得了这三个蛋白与 NADPH 的复合物晶体， 分辨率分别为 1.98 Å（5Z2X），2.20 Å（5ZED）和 1.78 Å（5ZEC）。选择距离参数 d (O14CPMK-H9Y164) ≤3.4 Å 和 d (C7CPMK-H4NPH) ≤4.5 Å 衡量酶催化底物过程中的预反应状 态，分子动力学模拟结果显示 Mu-R2 与 CPMKProR及 Mu-S5 与 CPMKProS更易形成预反 应状态。对于突变体 Mu-S5，其底物结合口袋入口处突变位点 N136，V161，C237 和 G214 的 α-碳原子可形成类平面的“极性门”。由于底物潜手性碳两侧氯苯环和吡啶环的带电差异，在催化过程中底物的取向在其穿过“极性门”时即被决定。对于野生型 KpADH，类似的平面被周围芳香族氨基酸残基的侧链阻挡，从而使底物在接近催化中 心时无法保持单一取向。

（4） 建立双芳基醇脱氢酶 KpADH 和葡萄糖脱氢酶 BmGDH 偶联反应体系，将双 酶共固定化实现双芳基手性醇(S)-CPMA 的酶法连续合成。确定最佳酶活力比例为 Mu-S5:BmGDH=2:1（U/U），使用 10 mL Ni-NTA 对酶进行固定化，使用羟丙基-β-环糊 精为助溶剂配制底物浓度为 10 mM 反应液，当流速为 5 mL·min-1 时反应 1-3 天底物转化 率均为 100%，计算反应时空产率为 1560 g·L-1 ·d-1 ，使用 D101 树脂吸附产物，最终产物 得率为 84.0%。

关键词：

醇脱氢酶；双芳基酮；高通量筛选；立体选择性翻转；分子改造

（4）

博士研究生：吕永坤

导 师：陈 坚

专 业：发酵工程

论 文 题 目：微生物合成水飞蓟宾的合成生物学研究

论 文 摘 要：

水飞蓟宾是一种黄酮木脂素类化合物，是治疗肝病和保肝护肝药物水飞蓟素的主要 活性成分。目前市场上的水飞蓟宾为水飞蓟植物的提取物。由于受到季节、气候和品种 等的影响和限制，存在产量有限和质量不稳定等诸多问题。利用生物转化或合成生物学 方法生产水飞蓟宾，可以有效解决这些问题。目前，水飞蓟宾的原生合成途径尚未完全 解析，成为微生物合成水飞蓟宾的主要障碍。因此，本论文对水飞蓟宾原生合成途径的 关键未知节点进行了解析。通过强化反应体系中过氧化氢酶活性，解决了香草醇氧化酶 在合成松柏醇过程中的反馈抑制和产物过度氧化问题。基于黄杉素途径的特点及解脂亚 洛酵母作为底盘的优势，对黄杉素合成途径进行了模块化，并在解脂亚洛酵母进行了构 建、验证和优化。通过自主调控解脂亚洛酵母中脂肪酸合成，提高了黄杉素合成效率。 最后，本研究构建了水飞蓟宾高效合成的方法。本论文不仅为微生物合成水飞蓟宾及其 前体化合物作出了基础性的工作，其中的水飞蓟宾和松柏醇转化方法也具有很强的应用 价值。本论文的主要研究内容如下：

(1) 解析了水飞蓟宾的原生合成途径。对水飞蓟不同组织中水飞蓟宾及其前体含量 进行分析，发现其分布的差异性；通过转录组测序发现，水飞蓟具有典型的黄酮类化合 物和苯丙素类化合物合成途径，相关基因在不同组织器官中的表达存在差异性；体外仿 生研究表明，过氧化物酶和漆酶可以实现水飞蓟宾的催化合成；通过转录组数据分析、 基因异源表达、过氧化物酶活性分析及水飞蓟宾合成能力分析，确定种皮中催化水飞蓟 宾合成的为抗坏血酸过氧化物酶 APX1；最后，提出了水飞蓟宾的原生合成途径及前体 的运输机制。

(2) 构建了高效的松柏醇转化体系。针对松柏醇原生合成途径在微生物中重构可能 存在转化率低的问题，提出了一种由 PsVAO 和过氧化氢酶组成的酶级联转化方法，可 以将丁香酚转化为松柏醇，同时，通过原位清除其中的 H2O2 解除对 PsVAO 的反馈抑制 并减少产物的过度氧化。对不同来源和种类的过氧化氢酶进行分析，筛选了 3 种具有较 高过氧化氢酶活性和低过氧化物酶活性的酶，并将其引入松柏醇合成反应体系中；通过 转化条件优化及补加丁香酚，在 1.5 L 反应规模下，合成了 22.9 g∙L -1 松柏醇，转化率和 生产强度分别为 78.7%和 0.5 g∙L -1 ∙h -1；最后，对产物进行了分离纯化鉴定。

(3) 构建了以解脂亚洛酵母解脂亚洛酵母为底盘的黄杉素合成菌株。根据黄酮类化 合物在微生物中合成普遍遇到的问题，及解脂亚洛酵母的特点，提出以解脂亚洛酵母为 底盘构建黄杉素合成途径；根据黄杉素合成途径的限速因素，对黄杉素合成途径进行了 模块化构建、验证和优化；并通过增加限速步骤基因拷贝数对合成途径进行优化；通过 强化分支酸途径和丙二酰辅酶 A 途径，强化了胞内前体供给，提高了黄杉素合成效率； 对发酵条件进行优化，发现较高的葡萄糖浓度和添加浅蓝菌素能够提高黄杉素的产量； 最后，在分批补料发酵中黄杉素的产量达到 99.8 mg∙L -1。

(4) 构建了基于 CRISPRi 的黄杉素前体供给的动态调控方法，提高了黄杉素合成效 率。构建了解脂亚洛酵母随机整合和定点整合方法，并对整合效率进行了验证；对一系 列启动子的脂肪酸诱导强度及动态范围进行了分析，选择嵌合启动子(A1R1)x2A3 用于脂 肪酸动态调控；设计并分析了不同 gRNA 对脂肪酸合成关键基因转录的阻遏效率，及其 对调控脂肪酸积累和黄杉素合成的影响；对不同基因进行了多基因组合阻遏分析，并研 究了对脂肪酸积累和黄杉素合成的影响；关键基因转录阻遏导致脂肪酸积累减少，黄杉 素合成增加，且关键基因转录水平与脂肪酸积累正相关，与和黄杉素合成负相关，表明 所设计的基于 CRISPRi 的脂肪酸动态调控方法发挥了预期的效果；对脂肪酸合成动态调 控下的发酵参数进行检测，证明了脂肪酸合成动态调控对提高黄杉素合成的效果。

(5) 构建了高效的水飞蓟宾合成方法。为了建立高效的水飞蓟宾合成方法，对不同 来源和种类的过氧化物酶进行分析，发现催化水飞蓟宾合成的能力与过氧化物酶的来源 和种类无关；建立了以香草醇氧化酶 PsVAO 和水飞蓟过氧化物酶 APX1 组成的酶级联 体系，可将丁香酚和黄杉素转化为水飞蓟宾和异水飞蓟宾，同时不产生任何有害代谢副 产物；对反应条件进行优化，获得了最优的 pH、温度、底物比例，及溶氧条件对反应 的影响；在 1.5 L 规模进行验证，12 h 内合成了 2.58 g∙L -1 水飞蓟宾和异水飞蓟宾，黄杉 素转化率为 76.7%。

关键词：水飞蓟宾；合成途径解析；解脂亚洛酵母；自主调控；合成生物学

（5）

博士研究生：王馨叶

导 师： 聂 尧

专 业：发酵工程

论 文 题 目：普鲁兰酶催化效率强化的分子改造及其分泌表达调控

论 文 摘 要：

普鲁兰酶（EC 3.2.1.41）是一类催化支链淀粉、普鲁兰多糖及相关聚合物的a-1,6 糖苷键水解的淀粉脱支酶。由于普鲁兰酶水解支链淀粉分支点的特性，在糖化过程中添 加普鲁兰酶，将减少所需的糖化酶用量以及糖化反应时间，从而显著ᨀ高淀粉生物质的 水解效率。因此，普鲁兰酶在食品、制药、能源和高聚物材料等领域有重要的商业价值。 而且，作为研究糖类物质结构的工具，普鲁兰酶也受到了极大的关注。然而，多数普鲁 兰酶的催化效率和稳定性较低，因此面临着生产成本ᨀ高，无法大规模应用于工业化生 产的问题。 长野芽孢杆菌（Bacillus naganoensis）来源的普鲁兰酶具有耐酸耐热的酶学特性， 在 pH 4.5，60 °C 条件下酶活水平最高。本论文基于序列结构信息对 B. naganoensis 普鲁 兰酶进行蛋白质工程改造。通过截断氨基酸序列的无序区域、进化偶联位点饱和突变、 三密码子饱和突变等策略，ᨀ高了 B. naganoensis 普鲁兰酶的酶活、比活、催化效率以 及应用效果。此外，分别通过在酶分子 N-末端融合带负电的多肽和过量表达羧肽酶的方 式ᨀ高了其在 E. coli 中的胞外分泌效率。主要研究结果如下：

（1）基于 B. naganoensis 普鲁兰酶氨基酸序列无序性分析的截短改造。通过酶的 二级结构预测以及无序性分析，依次删除普鲁兰酶 N-末端或 C-末端的无序区域，构建 了 8 个截短突变体。突变体DN5 和DN106 的比活力分别为 410 U·mg-1 和 490 U·mg-1 ，分 别是野生型的 1.1 倍和 1.3 倍。对动力学参数以及酶学性质的进一步研究表明，DN5 和 DN106 的催化效率都有ᨀ高，其 kcat/KM值分别为野生型的 2.2 倍和 1.4 倍。DN5 的最适 反应温度和最适反应 pH 分别为 60 °C，pH 4.5，与野生型一致。DN106 的最适反应温度 和最适反应 pH 分别为 55 °C，pH 5.0。DN5 和DN106 的半衰期均比 WT 延长了 1 h。

（2）B. naganoensis 普鲁兰酶氨基酸序列进化偶联分析及共变残基对饱和突变。依 据蛋白质氨基酸序列在自然进化过程中存在进化偶联关系以维持其结构-功能的理论基 础，建立进化偶联饱和突变的策略对 B. naganoensis 普鲁兰酶进行改造。利用进化偶联 分析工具 EVcouplings 分析普鲁兰酶的氨基酸全序列的进化偶联位点。对进化偶联强度 高的残基对进行分区，根据进化偶联强度以及空间分布位置选择残基对进行饱和突变， 构建相应的突变文库。筛选得到催化效率ᨀ高的突变体 A232G/I226A，其比活力ᨀ高到 了 550 U·mg-1 ，为野生型的 1.5 倍，kcat/KM值为野生型的 2.2 倍。A232G/I226A 的最适 反应温度和最适反应 pH 分别为 60 °C，pH 5.0。突变体的半衰期均短于野生型。

（3）B. naganoensis 普鲁兰酶催化结构域、底物结合结构域 CBM48 的氨基酸序列 进化偶联分析及饱和突变。使用 EVcouplings 分别分析催化结构域、CBM48 和催化结构 域、催化结构域和 C-末端区域的氨基酸序列内的进化偶联位点。并且，使用 EVcomplex 分析催化结构域与 CBM48 氨基酸序列之间的进化偶联位点。比较分析进化偶联强度较 高的残基对在蛋白空间结构的分布情况，选择目标残基对进行饱和突变，构建相应的突 变文库。通过筛选得到双位点突变体 V328L/I565L 的比活力ᨀ高到了 870 U·mg-1 是野生 型的 2.3 倍，突变体 K631V/Q597S 的 kcat/KM值为野生型的 5.6 倍。选择比活力最高的五个突变体两两组合，得到的四位点突变体 K631V/Q597K/D541I/D473E 的比活力ᨀ高到 1,000 U·mg-1 ，是野生型的 2.7 倍；其 kcat/KM 值也是所有突变体中最高的，为野生型的 6.3 倍。突变体的最适反应 pH 与野生型一致，而其中 D541I/D473E，D541I/D473Q， K631V/Q597K/D541I/D473E，K631V/Q597S/D541I/D473E 的最适反应温度降为 55 °C。 在位点 D541/D473 的突变会引起普鲁兰酶半衰期的缩短，其他突变体的半衰期与野生型 基本一致。

（4）B. naganoensis 普鲁兰酶催化口袋活性位点组合饱和突变。与已有 3D 晶体结 构的普鲁兰酶进行结构以及序列比对，选择 B. naganoensis 普鲁兰酶催化口袋内的 9 个 潜在功能位点进行突变。结合同源序列比对信息，选择相应位点保守性高的色氨酸，酪 氨酸和天冬酰胺作为建构单元进行三密码子饱和突变。根据实验结果推测出与催化相关 的未知功能位点 D787 和 M621，进一步对其进行饱和突变，构建突变文库。最终筛选 得到催化效率ᨀ高的突变体 D787C，其比活力ᨀ高到了 550 U·mg-1 ，是野生型的 1.5 倍， kcat/KM值为野生型的 1.8 倍。突变体 D787C 的最适反应温度、pH 和半衰期与野生型一 致。

（5）ᨀ高B. naganoensis普鲁兰酶在Escherichia coli中的分泌调控及突变体的应用。 通过在 B. naganoensis 普鲁兰酶的 N-末端融合带负电荷的多肽，如天冬氨酸标签，纤维 素酶催化结构域 N-末端前 20 位氨基酸，超折叠绿色荧光蛋白，ᨀ高了普鲁兰酶在 E. coli 中的胞外分泌水平。此外，通过过量表达羧肽酶修饰 E. coli 细胞壁结构，从而ᨀ高普鲁 兰酶在 E. coli 中的分泌效率。将前期构建的突变体 DN5 、 DN106 、 K631V/Q597S/V328L/I565L、K631V/Q597K/D541I/D473E、D787C 进行组合，得到比活 水平最高的组合突变体DN106-K631V/Q597K/D541I/D473E/D787C。其比活力为 1,100 U·mg-1 ，是野生型的 2.9 倍，最适反应条件为 pH 5.0，55 °C，且半衰期与野生型一致。 将突变体DN106-K631V/Q597K/D541I/D473E/D787C、野生型普鲁兰酶、商品普鲁兰酶 分别与糖化酶进行复配。在反应时间达到 72 h 时，添加突变体的反应体系的 DE 值接近 于添加商品普鲁兰酶的效果，与野生型相比 DE 值从 99%ᨀ高到了 99.4%。并且，在糖 化反应的中后期，突变体参与的反应的 IM 值最低，即葡萄糖逆向聚合生成异麦芽糖的 水平最低。

关键词：

普鲁兰酶；氨基酸序列分析；分子改造；大肠杆菌；分泌表达