（1）硕士研究生： 程 功（2017年江苏省优秀硕士学位论文）

导师： 张伟国 教授

专业： 生物工程

论文题目：L-精氨酸高产菌的选育及其发酵条件的研究

摘要：L-精氨酸（L-arginine, Arg）是半必需的碱性氨基酸，因其具有特殊的生理功能，而被广泛应

用于饲料、医药、食品以及化妆品等行业。随着我国对L-精氨酸的需求量迅速增长，目前国内生产能力已

不能满足市场的需求。且国内精制L-精氨酸主要依赖于进口。因此，为打破国外L-精氨酸生产垄断地位，

选育出具有自主知识产权的L-精氨酸生产菌株具有重要意义。本文以传统诱变方法赋予出发菌株特定的抗

性标记来提高L-精氨酸产量，随后初步分析该突变株中L-精氨酸产量提高的原因，优化发酵培养基及发酵

条件，拓展菌株底物利用以及在分批过程中优化溶氧及补糖。主要研究结果如下：

1.以Corynebacterium glutamicum GUI096为出发菌株，经常压室温等离子体生物诱变系统逐级诱变

处理，赋予出发菌株新的遗传标记L-高精氨酸抗性（L-HAr）和8-氮鸟嘌呤抗性（8-AGr），筛选出一株

L-精氨酸产量较高的突变株C. glutamicumARG 3-16，该突变株对L-HA和8-AG的耐受浓度分别达到15

g·L-1和0.7 g·L-1，L-精氨酸产量达到35.95±0.74 g·L-1，比出发菌株提高了49.79%。

2.对突变株C. glutamicum ARG 3-16的基因核苷酸序列分析，实验发现关键酶基因argB（编码N2-乙

酰谷氨酸激酶）、argJ基因（编码鸟氨酸乙酰转移酶）以及阻遏蛋白基因argR发生了不同程度的突变，它

们编码的酶氨基酸序列也发生了相应的改变，特别是argR基因的突变导致编码阻遏蛋白翻译提前终止，从

而解除了反馈阻遏作用。N2-乙酰谷氨酸激酶对外源L-精氨酸耐受性实验发现突变株中N2-乙酰谷氨酸激

酶对外源L-精氨酸耐受性增强，从而表明L-精氨酸对N2-乙酰谷氨酸激酶的反馈抑制作用得到弱化。

3.在单因子实验的基础上，应用Plackett-Burman设计从7个因素中筛选出对L-精氨酸合成具有显著效

应的(NH4)2SO4、葡萄糖和尿素3个因素。通过Box-Behnkne实验分析了发酵生产L-精氨酸的最优摇瓶发

酵培养基（g·L-1）：葡萄糖155，(NH4)2SO4 58.95，玉米浆20，尿素2.2，KH2PO4 0.75，MgSO4·

7H2O 0.5，生物素8.0×10-5。并通过单因素实验优化了L-精氨酸发酵条件如下：初始pH 7.0，发酵温度

30°C，碳酸钙40 g·L-1，装液量30 mL，接种量10%，种龄16 h，最终产酸达到41.38±0.85 g·L-1，

比优化前提高了15.10%。

4.甜菜糖蜜是蔗糖工业的副产物，含有丰富的营养物质。本实验将甜菜糖蜜与葡萄糖进行协同发酵生

产L-精氨酸，实验发现当混合发酵甜菜糖蜜的质量比为15%时L-精氨酸产量最高，达到42.88±0.63 g·

L-1。研究发现甜菜碱是甜菜糖蜜中影响L-精氨酸产量的最主要的因素，当甜菜碱1 g·L-1时L-精氨酸产

量达到最高（即44.27±0.87 g·L-1），比添加前提高了6.98%。其原因可能是甜菜碱可以直接进入胞内

保护胞内酶的活性，提高菌株渗透压耐受性来促进细胞的生长。

5.在7 L发酵罐中对L-精氨酸发酵过程中的溶氧和补糖进行了控制优化。研究发现在L-精氨酸发酵过程

的不同发酵阶段以不同供氧方式来控制发酵培养基中的溶氧浓度，从而可以促进L-精氨酸的积累。分阶段

溶氧控制下L-精氨酸产量达到53.21±0.94g·L-1，比优化前提高了9.69%。另外通过分阶段流加葡萄糖

来控制发酵培养基中葡萄糖浓度在10-30 g·L-1范围内，以降低渗透压对菌体生长和L-精氨酸合成的影

响，最终L-精氨酸产量达到58.34±1.25 g·L-1。

关键词：L-精氨酸；谷氨酸棒状杆菌；选育；常压室温等离子体；优化

（2）硕士研究生： 樊祥臣（2017年江苏省优秀硕士学术学位论文）

导师： 刘立明 教授

专业： 发酵工程

论文题目：L-谷氨酸酶法生产α-酮戊二酸的条件优化

摘要：α-酮戊二酸(alpha-ketoglutaric acid, α-KG)作为一种重要的有机酸，被广泛应用于医药、食品

和精细化工等领域，目前酶法催化L-谷氨酸生产α-KG的研究已取得一定进展。本研究室前期构建了一条

利用重组L-谷氨酸氧化酶(L-glutamate oxidase, LGOX)催化L-谷氨酸生产α-KG的新途径。但仍存在

LGOX产酶效率低，不能满足工业化生产和市场需求，催化过程中需要添加过氧化氢酶消除副产物H2O2的

抑制作用，增加了生产成本等缺点。为有效解决这些问题，本文从高密度发酵技术和构建高效双酶共表达

菌株两个方面开展研究，为LGOX酶法生产α-KG的工业化生产开辟前景。主要的研究结果如下：

1.通过提高细胞密度和LGOX酶活的策略提高LGOX产量。以工程菌株FMME089为出发菌株，采用廉

价、无毒的乳糖代替IPTG作为诱导剂，LGOX酶活由3.12 U·mL-1提高到4.73 U·mL-1；在对DO-

stat和指数补料分析基础上，提出了指数补料与DO-stat相结合的两阶段补料策略，将细胞浓度由2.49 g·

L-1提高到41.6 g·L-1，LGOX酶活为59U·mL-1。通过优化指数补料速率μset和诱导条件，细胞浓度达

到48.4 g·L-1，LGOX酶活提高到156.1 U·mL-1，分别是摇瓶发酵的19.4倍和50倍。

2.高密度细胞直接应用于全细胞转化L-谷氨酸生产α-KG，在110 g·L-1底物水平下，单位体积发酵液

所得菌体转化获得α-KG的量是较摇瓶菌体的48倍。进一步提高底物浓度，通过优化反应体系，反应24 h

132 g·L-1底物条件下α-KG产量达到127.2 g·L-1，转化率为97.0 %，产量提高了23.3%。

3.通过对LGOX和KatG过氧化氢酶-过氧化物酶基因)酶学性质的研究，评估其催化水平；随后在转录水

平构建LGOX和KatG共表达菌株，发现单启动子双酶串联表达菌株F008更有利于α-KG的生产；随后，对单

启动子双酶串联表达菌株中KatG基因前的SD序列与ATG之间的间隔进行优化，分别间隔3 bp, 6 bp, 9 bp和

12 bp获得菌株FXC003~FXC006，分析产酶效果和转化效果发现FXC005的效果最优，LGOX和KatG酶活分

别为2.86 U·mL-1和935.8 U·mL-1，转化24 h α-KG产量提高到86.7 g·L-1，转化率79.6%，仍没有

达到完全替代过氧化氢酶的目的；因此，通过计算预测合适翻译起始速率(TIF)的RBS序列以提高KatG有效

表达量，得到一株高效生产LGOX和KatG的共表达菌株F006。F006在TB培养基中，OD600=0.6时0.4

mmol·L-1 IPTG诱导5 h，LGOX和KatG酶活分别为2.09 U·mL-1和1185.3 U·mL-1，此时全细胞催化

110 g·L-1 L-谷氨酸24 h，α-KG产量达到103.1 g·L-1，转化率为94.6%，很好的解决了需要添加外源

过氧化氢酶的问题。

关键词：L-谷氨酸氧化酶；高密度发酵；双酶反应体系；共表达菌株；全细胞转化。