博士研究生：高聪（2021年江苏省优秀博士学术学位论文）

导师：刘立明 教授

专业： 发酵工程

论文题目：大肠杆菌碳代谢流的调控方法及其在有机酸生产中的应用

摘要：微生物细胞工厂可以利用廉价生物质生产多样的化学品,其合成能力的指标,如产量、产量和生产强度往往取决于胞内代谢流的流量、流向和流速。因此,调控碳代谢流是构建高效微生物细胞工厂的关键。在提高微生物化学品合成能力的过程中,普遍存在合成路径中碳流量调控精度低、细胞生长和产品合成之间的碳流分布难以平衡、调控工具的智能性、时效性和通用性差等问题。本论文以E.coli为研究模型,从合成生物学和系统代谢工程的角度,提出了体外模块优化整合CRISPRi、动态统合加工、蛋白酶为基础基因回路等策略,有效提高了苹果酸、木糖酸、莽草酸等有机酸的生产指标。主要结果如下:1.以E.coli B0013为出发菌株,通过体外构建、模块优化苹果酸非循环氧化乙醛酸合成路径,获得了五种路径酶的最适催化比例;利用基因组合敲除的方式,构建了一株能积累5.30 g L^-1苹果酸的底盘工程菌株E.coli B0044;通过筛选、组装靶向路径酶的不同抑制强度的向导RNA,并利用CRISPRi技术对路径酶进行理性调控,获得了最优工程菌株E.coli B0047。最终通过补料分批发酵生产36 g L^-1苹果酸,得率为0.74 mol mol^-1葡萄糖。2.通过筛选不同来源的木聚糖降解酶和木糖转运蛋白,并进一步模块优化,获得了具有高效木聚糖利用能力的E.coli;进一步的,经过整合、优化群体感应QS系统和重组酶Cre系统,构建了一个细胞密度依赖型的新型动态调控开关,展示出良好的可调性和可移植性;最终通过组合上述两个系统,提出了微生物动态统合生物加工技术。利用该技术,工程E.coli以20 g L^-1木聚糖为底物分别生产出16.8 g L^-1木糖酸,11.8 g L^-1木糖醇和3.2 g L^-1莽草酸。3.通过组合蛋白酶和蛋白降解信号,构建了两种基本的蛋白调控单元。两个调控单元的最大调控倍数均超过20倍,展示出良好的可调性和特异性;在此基础上,GPP控制靶蛋白的表达,SPP控制蛋白酶的表达,设计出转换时间分布于7-10 h的pbDRC分子生物开关;同时表达两种具有正交切割活性的蛋白酶（TEVp,TVMVp）或者利用蛋白酶的级联降解,构建出pbI分子生物开关;使用三种具有正交切割活性的蛋白酶（TEVp,TVMVp,SuMMVp）级联降解,首次在蛋白水平构建出震荡周期为90 min,具有生物功能的振荡器pbO。4.以莽草酸激酶为靶点,研究了pbDRC对菌株在不添加芳香族氨基酸和诱导剂的无机盐培养基中生产莽草酸的影响。在摇瓶水平,最优菌株E.coli DS7的莽草酸产量达2.14 g L^-1;补料分批发酵,72 h可以积累12.6 g L^-1莽草酸,比摇瓶水平提高了5.9倍,得率达0.19 g g^-1葡萄糖;在其他E.coli中测试pbDRC,莽草酸产量分别较对照组提升7-43倍;在基因组水平上引入pbDRC,莽草酸产量分别较对照组提升4-9倍,且未积累乙酸。5.以PTS系统为靶点,研究了pbI对缓解碳代谢阻遏的影响。利用逆变器可以改变菌株对葡萄糖利用情况。最佳的诱导剂添加时间是6 h,在此条件下,当底物含20 g L^-1葡萄糖和10 g L^-1木糖时,含有逆变器的菌株可以积累4.25 g L^-1木糖酸,较对照组的2.37g L^-1产量,提高了1.79倍。6.以酯水解酶为靶点,研究了利用pbO调控双酶级联反应速率对生产木糖酸的影响。在摇瓶水平上,含有pbO系统的菌株较对照组木糖酸产量提高2.02倍;且在胞外pH=4的情况下,保持了胞内的pH稳态;相较于对照组,含有pbO的菌株单位菌落形成单位提高了两个数量级;经过发酵条件优化,在TB培养基,37°C条件下,木糖酸的摇瓶产量达13.1 g L^-1;经补料分批发酵,木糖酸的生产强度达到7.12 g L^-1 h^-1,产量达199.4 g L^-1。

关键词：代谢工程;碳流调控;有机酸;合成生物学;基因回路

硕士研究生：王露露（2021年江苏省优秀硕士学术学位论文）

导师：徐岩 教授

专业： 发酵工程

论文题目：酱香型白酒中呈“盐菜味”异嗅味关键香气化合物解析

摘要：“盐菜味”异嗅是我国酱香型白酒中经常出现的一类风味质量缺陷。目前“盐菜味”异嗅风味化学本质不清晰,酿酒生产过程难以对其进行有效的控制,由此造成的酱香型白酒行业经济损失十分突出。本研究基于分子感官科学研究思路,试图通过多种研究策略的应用系统解析构成酱香型白酒“盐菜味”异嗅缺陷的风味化学本质,并建立快速判定酱香型白酒“盐菜味”质量缺陷的技术方法。主要研究内容及结论如下:（1）采用正相色谱预分离联合气相色谱-嗅闻/质谱（GC-O/MS）技术对典型“盐菜味”酒样中的香气活性化合物进行分析。但在样品中没有鉴定出直接呈“盐菜味”特征的化合物,验证了酱香型白酒中“盐菜味”异嗅为不同香气化合物复合构成的香气特征。采用全二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GC-TOF/MS）技术对酱香型白酒样品中的挥发性化合物进行了全面鉴定分析,构建了包含1086种化合物的酱香型白酒挥发性组分信息库,为酱香型白酒香气特征的解析奠定基础。（2）进一步采用分子感官组学思路解析了构成酱香型白酒“盐菜味”复合香气特征的关键香气化合物。通过比较香气萃取稀释分析（cADEA）技术对比分析了“盐菜味”异嗅样品和正常样品香气活性组分差异;基于香气化合物精确定量和香气活力值（OAV）分析筛选出23种含量差异显著的重要香气化合物;进一步通过对30个不同“盐菜味”强度酒样中重要香气化合物含量的统计分析,首次发现2-甲基-3-呋喃硫醇、糠硫醇、甲基2-甲基-3-呋喃基二硫、双（2-甲基-3-呋喃基）二硫、甲硫醇、二甲基二硫、二甲基三硫以及3-甲硫基丙醛等微量香气物质是酱香型白酒“盐菜味”异嗅的重要贡献物质;最后通过香气添加、缺失实验确认了“量微香大”的含硫化合物含量失调是造成酱香型白酒“盐菜味”缺陷的关键因素。（3）建立了基于气相色谱火焰光度检测技术（GC-PFPD）结合多元统计分析快速判别酱香型白酒“盐菜味”质量缺陷的方法。采用GC-PFPD对不同“盐菜味”强度酱香型白酒样品中的含硫化合物进行全面量化分析。利用多元统计分析筛选出6种与酱香型白酒风味品质显著相关的标志性含硫化合物。基于关键判别因子构建了快速判别酱香型白酒风味品质的分析模型,模型验证结果显示判定准确率达到100%。

关键词：酱香型白酒;“盐菜味”异嗅;分子感官科学;多元统计分析;含硫化合物;

硕士研究生：侯建屾（2021年江苏省优秀硕士学术学位论文）

导师：刘立明 教授

专业：微生物学

论文题目：动态分子开关调控大肠杆菌生产莽草酸和葡萄糖二酸

摘要：生长偶联型启动子具有在对数期高强度表达,进入稳定期后停止表达的特点。本研究以生长偶联型启动子和降解标签组建动态下调开关,以生长偶联型启动子（GPP）、阻遏蛋白、降解标签（ssrA）为基础构建动态上调开关,在成功构建动态上调开关和动态下调开关的基础上,将两种开关合并,以正交的方式分别对两种目的蛋白同时实现上调和下调。莽草酸是大肠杆菌合成芳香族氨基酸的中间代谢物,也是抗流感药物“达菲”的重要前体。葡萄糖二酸是合成多种高效环保的新兴生物质能源的原料,具有巨大的潜在经济价值。而莽草酸和葡萄糖二酸在生物合成中,面临着合成路径与细胞生长竞争前体物质的问题。因此本研究使用分子开关将细胞生长与产物合成解偶联,实现碳代谢流的自主分配。然后应用到大肠杆菌的内源代谢路径中生产莽草酸,和外源代谢路径中生产葡萄糖二酸。主要结果如下所示:1.首先构建生长偶联型启动子文库,以启动子相对活性的峰值为评测标准,最终选择不同强度的启动子rpsL、rpsT P1、rpsA P1、rrnA P1和rrnC P1用于分子开关的组建。构建由ssrA降解标签组成的文库,以降解速率为降解标签的评测标准,选择不同强度的降解标签LAA、DAS+4、DAS+8、GSD和DAS用于后续的研究。接下来使用5种生长偶联型启动子和5个强度的降解标签控制GFP的表达,获得25种动态下调开关,按照25种分子开关的积分,选择不同强度的rrnC-DAS、rrnA-GSD、rrnA-DAS+8、rpsA-DAS+4、rpsA-LAA五种分子开关用于后续实验。使用上述原件对tet原核表达系统进行改造构建动态上调开关,5种动态上调开关具有11.35倍的动态范围:荧光强度最强的为H016,为对照组的85.07%。最后将动态上调开关与动态下调开关合并,组建双功能开关,以正交的方式分别对两种目的蛋白同时实现上调和下调使GFP荧光强度降低了11.31倍,而mKate2荧光强度提高了6.04倍。2.然后将双功能分子开关应用到大肠杆菌的内源代谢路径中,通过使用双功能分子开关调控碳流量实现莽草酸的合成与大肠杆菌的生长解偶联。使用glf替换ptsHIcrr,并对aroL和aroK进行敲除,构建莽草酸生产菌株。接下来将双功能分子开关应用到莽草酸的生产中,经过72 h发酵后筛选出最优生产菌株H204,莽草酸积累量为1.64 g·L^-1。对其他基因型的大肠杆菌如DH5α、JM109、W3110、ATCC 8739和B0013在相同的位点进行改造。含双功能开关菌株的莽草酸产量相比对照组具有13.84到69.53倍的提升。菌株H204置于5 L发酵罐中进行发酵测试,经过72 h发酵,产量升高到14.33 g·L^-1。3.最后将双功能分子开关应用到大肠杆菌的外源代谢路径中,通过使用双功能分子开关调控碳流量分布生产葡萄糖二酸。敲除基因uxaC、gudD和pfkA构建底盘微生物,将双功能分子开关应用到葡萄糖二酸的生产中,经过48 h发酵后筛选出最优生产菌株H305,OD₆₀₀为4.22,葡萄糖二酸的产量为1.16 g·L^-1。对其他基因型的大肠杆菌如DH5α、JM109、W3110、ATCC 8739和B0013在相同的位点进行改造。所有含双功能开关的菌株葡萄糖二酸产量具有9.76倍的动态范围。将最优菌株H305置于5 L发酵罐中进行发酵测试,经过48 h发酵,最终积累1.56 g·L^-1葡萄糖二酸。

关键词：分子开关;大肠杆菌;莽草酸;葡萄糖二酸;碳代谢流;

硕士研究生：魏冬（2021年江苏省优秀硕士学术学位论文）

导师：范文来 教授

专业： 发酵工程

论文题目：白酒糟中ACE抑制肽的鉴定与活性探究

摘要：白酒糟是高粱等农作物蒸煮加曲后经固态发酵、蒸馏后的残渣,含有较丰富的营养成分,是一种非常具有利用价值的资源。早期的研究大都集中在白酒糟的理化指标以及基本营养成分,而对其多肽组分尤其是血管紧张素转换酶（angiotensin-I-converting enzyme,ACE）抑制肽成分的研究却未见报道。世界卫生组织（world health organization,WHO）认定高血压是心血管疾病重要来源,ACE抑制肽由于其对ACE的抑制能力因而对降血压有一定效果。近年来已有在酒醅和白酒中发现ACE抑制肽的报道,故白酒糟中很可能存在较多的ACE抑制肽。因此,本课题以三大香型之一的中国浓香型白酒糟为研究对象,以ACE抑制活性为导向采用超滤、大孔树脂吸附层析和反相高效液相色谱法（reversed phase performance liquid chromatography,RP-HPLC）分离制备白酒糟中的多肽组分,并结合超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术（ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight-mass spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS）对白酒糟中的游离态和结合态多肽进行结构鉴定。采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术（ultra-performance liquid chromatography-triple-quadrupole-mass spectrometry,UPLC-QQQ-MS）定量分析了白酒糟中的ACE抑制肽,明确白酒糟中ACE抑制肽的结构以及含量分布;通过活性测定间接表征了这些多肽对抑制ACE蛋白的贡献;本研究进一步通过ProteinPilot软件结合蛋白质检索数据库Uniprot,对游离态ACE抑制肽的进行溯源分析,白酒酒糟中ACE抑制肽的研究对白酒糟的综合化利用以及提高附加值提供重要的理论参考。主要研究内容及结果如下:（1）首次采用UPLC-Q-TOF-MS结合多肽解析软件Biolynx鉴定白酒糟中的游离态ACE抑制肽,在ACE抑制活性较高的洗脱组分中鉴定出4种ACE抑制肽（含新发现的ACE抑制肽NGGPPT）。首次采用UPLC-Q-TOF-MS结合ProteinPilot软件对白酒糟中ACE抑制活性较高的洗脱组分进行多肽的微生物溯源分析,拟以浓香型白酒酿造过程中常见的功能微生物如乳酸菌、醋酸杆菌、酵母菌等为来源对象,在各洗脱组分中共鉴定出22种肽段,其中在20%乙醇洗脱组分中共鉴定出17种肽段,50%乙醇洗脱组分中鉴定出5种肽段,其中在酿酒酵母中鉴定出最多的肽段（12种）,而醋酸杆菌中所鉴定的肽段数目最少（2种）。（2）基于ACE抑制活性导向原则,本研究针对DDSG-PI的碱性蛋白酶酶解液建立超滤技术结合半制备RP-HPLC的分离纯化体系,通过测定不同分子量范围的超滤组分和RP-HPLC洗脱组分的半抑制浓度(concentration inducing 50%inhibition,IC₅₀),筛选出活性较高的组分进行质谱鉴定。结果表明＜1 kDa的超滤组分的ACE抑制活性最高(IC₅₀=6.75μg?m L^-1),且产率高达84.18%;经RP-HPLC优化后,其中组分Ⅱ～Ⅷ的ACE抑制活性均在70%以上,其中组分Ⅵ的活性最高,为88.99%。（3）以DDSG-PI碱性蛋白酶酶解液经超滤结合RP-HPLC纯化后的Ⅱ～Ⅷ组分为研究对象,首次采用UPLC-Q-TOF-MS结合Biolynx鉴定白酒糟中的结合态的ACE抑制肽。共鉴定出6种新的ACE抑制肽,分别是NQL、AVQ、YPQ、AYLQ、VLPVLS、VLPSLN;多肽AVQ表现出最高的ACE抑制活性,其IC₅₀值为181.19μmol?L^-1。（4）首次在白酒糟中采用UPLC-QQQ-MS对目标多肽进行质谱的参数优化并定量白酒糟中的结合态ACE抑制肽,以多反应监测（multiple reaction monitoring,MRM）模式完成定量质谱数据的采集,结果显示白酒糟结合态的ACE抑制肽的含量分布在0.17～16.96 mgg^-1DW之间,其中多肽VLPVLS的含量最高（16.96 mgg^-~1DW）;（5）酶动力学研究结果表明多肽AVQ和YPQ是ACE的非竞争性抑制剂。采用AutoDock软件将ACE抑制活性最强的多肽AVQ和YPQ与受体蛋白对接,分析其与ACE蛋白的作用位点。分子对接结果表明多肽AVQ和YPQ能与ACE蛋白的活性中心稳定结合,且Gln281,His353,Ala354,Ser355,Glu384,Lys511,His513,Tyr523残基都能对多肽与ACE蛋白有效结合产生重要的影响。

关键词：白酒糟;醇溶蛋白;ACE抑制肽;超滤;分子对接;