近期，我校生物工程学院周哲敏教授团队在L-天冬氨酸生物合成方面取得重要进展，研究成果“Developing a green and efficient biosynthesis system for L-aspartic acid by addressing enzyme imbalance and catalysis-extraction circulation processes”正式发表于Green Chemistry (https://doi.org/10.1039/D3GC03050D) (IF=9.8)。

L-天冬氨酸具有广泛的用途和应用范围，广泛应用于各行各业。天冬氨酸的合成涉及化学合成和生物催化。化学合成具有一定的优势，包括工艺简单、收率高，但需要在高温高压下反应。为了克服化学合成的局限性，课题组先前已经开发了一个从顺丁烯二酸酐通过双酶偶联催化生物合成L-天冬氨酸的系统，然而在催化过程中观察到这两种酶的利用不平衡，需要通过调节双酶酶活比例来达到系统的最大利用率。此外工业提取天冬氨酸所用的硫酸会造成环境污染，对于这一工艺流程进行优化可以提高经济效益、减少污染。

周哲敏教授团队针对双酶体系中的限速酶马来酸顺反异构酶（MaiA）稳定性较差且表达水平较低的缺点进行改造。稳定性方面使用FireProt在线软件进行计算和分析，并结合分子动力学模拟，设计了九种突变体。测量表达变体的活性，Q96E/A100M突变体转化率显著提高。以Q96E/A100M变体取代双酶系统中的原始MaiA，在12小时转化率达到86.8%，而原始菌株在12小时仅达到60.5%。测量变体酶学性质，Q96E/A100M的比活力与原始MaiA无显著差异，但热稳定性显著提升，60℃孵育4h后，原始MaiA的残留活性为48.7%，Q96E/A100M变体为81.1%。可以推断在Q96E/A100M菌株中观察到的生物催化的显著改善主要是由于Q96E/A100M变体的热稳定性增加。为了进一步提高催化效率，通过修饰基因的表达元件和数量来调节这两种酶的表达水平。首先删除了AspA的T7启动子并减弱了其RBS序列，重组菌株ES1转化率增加。SDS-PAGE显示MaiA的表达水平增加，AspA的表达水平降低，这表明两种酶在双酶系统中的表达水平是相互影响的。其次，分别通过串联使用几个T7启动子和增加MaiA基因的拷贝数来增强MaiA的表达水平。两种策略都提升了菌株催化效率，其中增加基因拷贝数的影响更为显著。对两种策略进行组合，最终的重组表达菌株ES1-4MaiA/5T7在8小时转化率达到了99.4%，生产率达到17.6 g/L · h · OD，与原系统的生产力(7.2 g/L · h · OD)相比显著提高。

在工艺优化方面，以顺丁烯二酸酐代替浓硫酸滴定L-天冬氨酸，解决了硫酸沉积所造成的环境污染问题。在萃取过程中向反应溶液中加入马来酸酐以降低pH值，L-天冬氨酸沉淀后，上清液中剩余的马来酸作为底物进入下一轮催化过程。共进行了5个循环的催化萃取实验，收率90.1%，L-天冬氨酸产品的纯度≥98%，完全满足工业生产的要求。

本研究成功地提高了双酶体系的催化效率，使得L-天冬氨酸的产率达到了最高记录，并发展了催化-萃取循环工艺，为工业L-天冬氨酸的生产提供了一种绿色、高效、经济的方法，对促进L-天冬氨酸的生产具有重要意义。

图形摘要

周哲敏教授和刘中美教授为论文的通讯作者，我校2021级硕士生王畅为第一作者。上述研究得到了国家自然科学基金（32271301）、江苏高校优势学科建设工程资助项目、高等教育学科创新项目（111-2-06）等资助。

近年来周哲敏教授团队以酶学与酶工程科学理论为指导，在系统开展酶分子定向改造及工业化应用等方面取得丰硕成果，相关研究成果已发表在Green Chemistry (2021)、Nucleic Acids Research (2021)、ACS Synthetic Biology (2021)、CS Catalysis (2020)、Food Chem (2019)、Biotechnol Bioeng (2019)、Appl Environ Microbiol (2019)等本领域权威期刊。